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本试剂盒根据染料法荧光定量PCR原理，在同一反应中同时检测端粒和一个单拷贝基因，根据两个扩增产生的荧光信号的比值来确定小鼠端粒的相对长度。

端粒是指真核细胞染色体末端独特的蛋白质-DNA结构，小鼠端粒由TTAGGG重复串联构成，长度约为30～50kb。端粒对于染色体的稳定非常重要，其主要通过防止染色体降解及端端融合来维护染色体的稳定和功能。因为线形染色体的末端复制问题，细胞每次分裂，端粒逐渐减少，直到达到关键长度，此时细胞步入老化阶段。因此，外周血白细胞的端粒长度与年龄呈负相关，快速检测端粒长度具有重要的意义。

• 即开即用，用户只需要提供小鼠外周血DNA模板。
  
• 操作只需要半天，比Southern杂交检测法快3～5天时间。
  
• 使用PCR扩增，几乎每个分子生物学实验都有相关设备，非常方便。
  
• 准确检测各种起始量的模板，扩增稳定、定量结果具有高度重复性。

1. 强烈建议每个样本做3次重复（定量实验至少需要3个生物学重复），按下表加入各成分：
   

   成分	样品管	内参管
   2×SYBR qPCR MasterMix	各10μL	各10μL
   小鼠端粒引物（10μM）	0.4μL	-
   小鼠端粒内参引物（10μM）	-	0.4μL
   待测DNA样本（0.5～5ng/μL）	各1μL	各1μL
   50×ROX（可选）	0.4μL	0.4μL
   超纯水	至20μL	至20μL

   • 可根据选择的仪器在反应体系中加入ROX染料，将反应体系中的荧光信号标准化。下表为所列使用不同仪器操作时所需的ROX量（每50μL反应体系）：
     

     仪器	每50μL反应所需ROX量
     ABI7300、7900HT、StepOne	5μL
     ABI7500、7500Fast、ViiA7、Stratagne Mx3000、Mx3005P以及Mx4000	1μL
     Roche仪器、Bio-Rad仪器、Eppendorf仪器	无需添加

2. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
   

   过程	温度	时间
   预变性	95℃	1分钟
   PCR反应 （35～40个循环）	95℃	10秒
   	55℃	30秒
   	72℃	45秒，采集（SYBR通道的荧光信号）
   熔解曲线分析

3. 熔解曲线分析：熔解曲线分析用于判断扩增是否有效。如果得到Tm分别为81℃（端粒PCR产物）和80℃（内参PCR产物）的两个峰，则表示实验有效，可以进入下一步分析。如果没有同时得到这两个峰，则表示扩增为非特异性扩增，实验无效，不需要分析Ct数据，需要找到原因后再继续实验。
   
4. 计算相对端粒长度：使用的2^-ΔΔCt法（Livak法）进行计算，得到T/S的比值作为端粒的相对长度。
   对于端粒，ΔCq（端粒）是两个基因组DNA样本之间端粒的定量Cq值之差：
   
   ΔCq（端粒）= Cq（端粒，样本2）- Cq（端粒，样本1）
   
   注意：ΔCq（端粒）的值可以是正数，0或负数。
   对于单拷贝内参，ΔCq（单拷贝内参）是两个基因组DNA样品之间单拷贝内参的定量Cq值之差：
   
   ΔCq（单拷贝内参）= Cq（单拷贝内参，样本2）- Cq（单拷贝内参，样本1）
   
   注意：ΔCq（单拷贝内参）的值可以是正数，0或负数。
   
   ΔΔCq = ΔCq（端粒）- ΔCq（单拷贝内参）
   
   样本2/样本1的相对端粒长度（倍数）= 2^-ΔΔCq。